Effect of tetrahydroquinoline derivatives on the intracellular Ca2+ homeostasis in breast cancer cells (MCF-7) and its relationship with apoptosis / Efecto de derivados de tetrahidroquinolinas sobre la homeostasis del Ca2+ intracelular en células de cáncer de mama (MCF-7) y su relación con la apoptosis

Abstract Tetrahydroquinoline derivatives are interesting structures exhibiting a wide range of biological activities, including antitumor effects. In this investigation, the effect of the synthesized tetrahydroquinolines JS-56 and JS-92 on apoptosis, intracellular Ca2+ concentration ([Ca2+]i), and the sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA) activity was determined on MCF-7 breast cancer cells. Colorimetric assays were used to assess MCF-7 cells viability and SERCA activity. Fura-2 and rhodamine 123 were used to measure the intracellular Ca2+ concentration and the mitochondrial electrochemical potential, respec tively. TUNEL assay was used to analyze DNA fragmentation, while caspase activity and NF-κB-dependent gene expression were assessed by luminescence. In silico models were used for molecular docking analysis. These compounds increase intracellular Ca2+ concentration; the main contribution is the Ca2+ entry from the extracellular milieu. Both JS-56 and JS-92 inhibit the activity of SERCA and dissipate the mitochondrial electrochemical potential through processes dependent and independent of the Ca2+ uptake by this organelle. Furthermore, JS-56 and JS-92 generate cytotoxicity in MCF-7 cells. The effect of JS-92 is higher than JS-56. Both compounds activate caspases 7 and 9, cause DNA fragmentation, and potentiate the effect of phorbol 12-myristate-13-acetate on NF-κB-dependent gene expression. Molecular docking analysis suggests that both compounds have a high interaction for SERCA, similar to thapsigargin. Both tetrahydroquinoline derivatives induced cell death through a combination of apoptotic events, increase [Ca2+]i, and inhibit SERCA activity by direct interaction.

Resumen Los derivados de tetrahidroquinolina son estructuras interesantes que exhiben una amplia gama de actividades biológicas, incluyendo efectos antitumorales. Se determinó el efecto de las tetrahidroquinolinas sintetizadas JS-56 y JS-92 sobre la apoptosis, concentración intracelular de Ca2+ ([Ca2+]i) y la actividad Ca2+-ATPasa del retículo sarco(endo)plásmico (SERCA) en células de cáncer de mama MCF-7. Se usaron ensayos colorimétricos para evaluar la viabilidad de las células MCF-7 y la actividad SERCA. Se emplearon Fura-2 y rodamina 123 para medir la concentración de Ca2+ intracelular y el potencial electroquímico mitocondrial, respectivamente. El ensayo TUNEL se utilizó para analizar la fragmentación del ADN, mientras que la actividad de caspasas y la expresión génica dependiente de NF-κB se evaluaron mediante luminiscencia. Modelos in silico permitieron el análisis del acoplamiento molecular. Estos compuestos aumentan la concentración de Ca2+ intracelular; la principal contribución es la entrada de Ca2+ desde el medio extracelular. Tanto JS-56 como JS-92 inhiben la actividad de SERCA y disipan el potencial electroquímico mitocondrial a través de procesos dependientes e independientes de la captación de Ca2+ por este orgánulo. Además, JS-56 y JS-92 generan citotoxicidad en células MCF-7. El efecto de JS-92 es mayor que JS-56. Ambos compuestos activan las caspasas 7 y 9, provocan la fragmentación del ADN y potencian el efecto del 12-miristato-13-acetato de forbol en la expresión génica dependiente de NF-κB. El análisis de acoplamiento molecular sugiere que ambos compuestos tienen una alta interacción con SERCA, similar a la tapsigargina. Ambos derivados de tetrahidroquinolina indujeron la muerte celular a través de una combinación de eventos apoptóticos, aumento de [Ca2+]i e inhibición de la actividad SERCA por interacción directa.

El Ca2+ y los esfingolípidos como moduladores de la apoptosis y el cáncer / Ca2+ and sphingolipids as modulators for apoptosis and cancer

El Ca2+ es un segundo mensajero que regula funciones directamente relacionadas con el cáncer como la proliferación, diferenciación y la apoptosis. La concentración intracelular de Ca2+ ([Ca2+]i) está altamente regulada por diversos mecanismos entre los que destacan canales iónicos, la Ca2+-ATPasa del retículo endoplasmático (SERCA) y de la membrana plasmática (PMCA), y el transporte de Ca2+ mitocondrial. En el cáncer, la célula tumoral prolifera sin control tras su incapacidad de reconocer señales apoptóticas. La apoptosis es mediada a través de cambios en la actividad de ciertas proteínas como las caspasas y miembros de la familia Bcl-2. Adicionalmente, el “estrés del retículo”, promovido por la acumulación y agregación de proteínas mal plegadas en el interior del retículo endoplasmático (RE), puede desencadenar la apoptosis. El “estrés del retículo” es inducido por una variedad de agentes, entre los que destaca la tapsigargina, inhibidor específico de la SERCA, la cual promueve un notable aumento en la [Ca2+]i, induciendo además apoptosis. En consecuencia, actualmente se están ensayando exitosamente derivados de la tapsigargina como agentes antineoplásicos. El Ca2+ es transferido a la mitocondria desencadenando señales apoptóticas. Por otra parte, los esfingolípidos, como la ceramida y la esfingosina, y sus derivados fosforilados, la ceramida-1-fosfato y la esfingosina-1-fosfato, los cuales regulan la [Ca2+]i, también están estrechamente vinculados con la señalización intracelular en procesos relacionados con el cáncer. Esta revisión discute nuevas evidencias sobre el efecto de estos esfingolípidos en la homeostasis de Ca+2 intracelular y su conexión con la apoptosis y el cáncer.

Ca2+ is a second messenger which regulates many functions directly related with cancer such as proliferation, differentiation and apoptosis. The intracellular Ca2+ concentration ([Ca2+]i) is finely regulated by several mechanisms, among them ionic channels, the endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA), the plasma membrane calcium pump (PMCA) and the mitochondrial Ca2+ transport. In cancer, the tumour cell proliferates without control since the capacity to recognize apoptotic signals has been lost. The apoptosis is regulated by changes in several proteins, as caspases and the Bcl-2 family members, among others. Additionally, the “reticulum stress”, promoted by the accumulation and aggregation of unfolded proteins in the interior of the endoplasmic reticulum (ER), ussually leads to apoptosis. The “reticulum stress” can be induced by several agents, remarkably with thapsigargin, a selective inhibitor of the SERCA, which in turn induces a large increment in [Ca2+]I, leading to apoptosis. As a consequence, currently, derivatives of thapsigargin are successfully been assayed as anti-neoplastic agents. Ca2+ is then transferred to the mitochondria, where it is known to constitute a main apoptotic signal. On the other hand, several sphingolipids, such as ceramide and sphingosine, and their phosphorylated derivatives ceramide-1-phosphate and sphingosine-1-phosphate, directly involved in the [Ca2+]I regulation, are also recognized as signal messengers related with cancer processes. In this review we discuss new evidences on the effect of several sphingolipids in the intracellular Ca2+ homeostasis and its relationship with apoptosis and cancer.

La Ca²+ -ATPasa de la membrana plasmática como enzima clave en la homeostasis intracelular del calcio: estimulación por etanol y otros efectores / The plasma membrane Ca²+ -ATPase as a key enzyme in the intracellular calcium homeostasis: stimulation by ethanol and other effectors

La Ca²+-ATPasa de la membrana plasmática (PMCA) es una enzima clave en la regulación de la concentración basal de Ca²+. Hemos demostrado que el etanol estimula la actividad de la Ca2+-ATPasa y el transporte de Ca²+ asociado. Cuando el etanol y la calmodulina (CaM) esta presentes simultáneamente, el efecto estimulatorio es aditivo, lo cual apoya que estos efectores actúan a través de distintos mecanismos. Mediante el uso de isoformas diferentes de la Ca²+-ATPasa se demostró que la variante PMCA2CI resultó ser mas sensible al efecto del etanol. Es Interesante resaltar que esta es la isoforma mas predominante en cerebro, cerebelo y tejido nervioso. Por otra parte, el fosfatidiletanol se forma mediante la transfosfatidilación de ciertos fosfolípidos cuando el etanol está presente, por una reacción que es catalizada por la fosfolipasa D. Este fosfolípido se acumula en la membrana de las células de mamífero luego del consumo de alcohol. Hemos demostrado que el fosfatidiletanol también estimula a la bomba de calcio de la membrana plasmática. Este fosfolípido incrementa la afinidad de la enzima por Ca²+ en mayor medida que la que se obtiene en presencia de CaM u otro fosfolípido acídico natural. Los esfingolípidos han sido reconocidos recientemente como importantes segundos mensajeros, actuando en varios sistemas en combinación con el Ca²+. En vista del hecho que la PMCA es estimulada por etanol, y tomando en cuenta que los esfingolípidos poseen grupos hidroxilo libres, decidimos estudiar el posible efecto de la ceramida y la esfingosina sobre esta bomba de calcio. Demostramos que la ceramida estimula a la Ca²+-ATPasa de una manera dosis-dependiente y de forma aditiva a la CaM y al etanol, cuando se compara con estos dos efectores añadidos separadamente. La ceramida afecta tanto la afinidad de la enzima por el Ca²+, como su Vmax. Mas aún, este esfingolípido también estimula el transporte de Ca²+ en vesículas invertidas de eritrocitos. Por lo contrario, la esfingosina...

Intracellular calcium homeostasis in Leishmania mexicana. Identification and characterization of a plasma membrane calmodulin-dependent Ca(2+)-ATPase

The intracellular Ca2+ concentration in different trypanosomatids is about 50 nanomolar, which concentration in different trypanosomatids is about 50 nanomolar, which is 4 orders of magnitude lower than in the extracellular milieu. This fact implies the existence of well developed mechanisms for the maintenance of such a high calcium gradient. In higher eukaryotics a number of different structures have been implicated in this function. Some of them are located in intracellular organelles, and others in the plasma membrane. Since intracellular organelles are limited by their storage capacity, long-term Ca2+ homeostasis resides solely in the plasma membrane. In higher eukaryotics, a calcium pump or Ca(2+)-ATPase located in the plasma membrane, because of its high Ca2+ affinity, has been proposed as the structure responsible for the maintenance of the cytoplasmic Ca2+ concentration at the submicromolar level. The presence of a Ca(2+)-ATPase in trypanosomatids has been debated. While some groups have reported its absence, others have reported the existence of an enzyme which is Mg(2+)-independent or even inhibited by Mg2+. On the other hand, in none of these reports any correlation was shown between the Ca(2+)-ATPase activity observed and the Ca2+ transport function attributed to this enzyme. We have previously shown that a calmodulin-stimulated Mg(2+)-dependent Ca(2+)-ATPase is present in the plasma membrane of Leishmania braziliensis and of Trypanosoma cruzi. Plasma membrane vesicles from these parasites are able to accumulate Ca2+ in the presence of the ATP-Mg complex. The similarities found between the kinetics parameters and other properties of the Ca(2+)-ATPase and the Ca2+ transport activity strongly suggest a common molecular entity. The stoichiometry calculated from these parameters approaches the 1:1 stoichiometry for Ca2+ and ATP, as reported for the Ca2+ pump from higher eukaryotic cells. In this report we show that plasma membrane vesicles from Leishmania mexicana possess a Ca(2+)-ATPase with characteristics which are similar to that reported by us for other trypanosomatids. Thus, the enzyme has a high Ca2+ affinity which is further increased upon addition of calmodulin. The maximal velocity is also increased by calmodulin...

Homeostasis intracelular del calcio: la calmodulina y la Ca2+ -ATPasa de la membrana plasmática de tripanosomatidios / Intracellular calcuim homeostasis calmodulin and the plasma menihane Ca2+ ATPase of trypanosomatids

La concentración citoplasmática de calcio iónico en todas las células eucarióticas estudiadas hasta el presente es de 4 órdenes de magnitud menor que la del exterior celular. En tripanosomatidios se ha determinado que la concentración intracelular de este cation es de alrededor de 50 mm, aun menor que la reportada en eucariotes superiores. Esta diferencia de concentración es mantenida mediante diversos sistemas de transporte ubicados a nivel de la membrana plasmática y en ciertos organelos intracelulares. En el caso de los tripanosomatidios, se ha identificado la presencia de un uniporte electroforético en la membrana interna de la mitocondria única gigante de estos parásitos, la cual presenta propiedades cinéticas esencialmente idénticas a las reportadas en aucariotes superiores. Este sistema presenta una afinidad por el Ca2+ incompatible con la posibilidad de mantener la concentración de este cation a nivel submicromolar. Por otra parte, contrario a lo reportado por otros autores, hemos identificado la presencia de una Ca2+ -ATPasa en la membrana plásmatica de Leishmania braziliensis, Leishmania mexicana, Trypanosoma cruzi y Tripanosona brucei. La enzima presenta alta afinidad por Ca2+ (Kmap Ca2+ = 0.5µM), es dependiente de Mg2+, y es estimulante por la calmodulina purificada de los mismos hemoflagelados. Esta Ca2+ -ATPasa es sensible al vanadato (Ki=1µM), lo cual permite identificarla como bomba iónica del tipo "P". Vesículas provenientes la membrana plasmática de estos parásitos son capaces de acumular Ca2+ en contra de un gradiente de concentración. Las características cinéticas de este transporte son similares a las de la Ca2+ -ATPasa, lo cual apoya que se trata de la misma entidad molecular. Los resultados obtenidos permiten postular que la Ca2+ -ATPasa es la estructura responsable del mantenimiento de la concentración intracelular de Ca2+ a nivel submicromolar a largo en estos parásitos